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    1. 上海遠慕生物科技有限公司

      RNA提取的常見問題分析
      點擊次數:22 發布時間:2022-07-28

       

        RNA的提?。簻蕚湓噭簂u仿,yi丙醇,75℅乙醇,無RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過的水配制)

        操作步驟:

        1. 勻漿處理:a.組織 將組織在液氮中磨碎,每50-100mg組織加入1ml TRIzol,用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10℅。

        b.單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞,每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml,用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定,不取決于細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

        c.細胞懸液 離心收集細胞,每5-10×106動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol,反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

        2.將勻漿樣品在室溫(15-30℃)放置5分鐘,使核酸蛋白復合物完全分離。

        3.可選步驟:如樣品中含有較多蛋白質,脂肪,多糖或胞外物質(肌肉,植物結節部分等)可于2-8℃10000×g離心10分鐘,取上清。離心得到的沉淀中包括細胞外膜,多糖,高分子量DNA,上清中含有RNA。處理脂肪組織時,上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

        5. 每使用1ml TRIzol加入0.2mllu仿,劇烈振蕩15秒,室溫放置3分鐘。

        6. 2-8℃10000×g離心15分鐘。樣品分為三層:底層為黃色有機相,上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中,水相體積約為所用TRIzol 試劑的60℅。

        7. 把水相轉移到新管中,如要分離DNA和蛋白質可保留有機相,進一步操作見后。用異丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇,室溫放置10分鐘。

        8. 2-8℃10000×g離心10分鐘,離心前看不出RNA沉淀,離心后在管側和管底出現膠狀沉淀。移去上清。

        9. 用75℅乙醇洗滌RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75℅乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鐘,棄上清。

        10.室溫放置干燥或真空抽干RNA沉淀,大約晾5-10分鐘即可.不要真空離心干燥,過于干燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5℅SDS,用槍頭吸打幾次,55-60℃放置10分鐘使RNA溶解.如RNA用于酶切反應,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去離子甲酰胺溶解,-70℃保存。

        注意事項:

        1.從少量樣品(1-10mg組織或102-104細胞)中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品,沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來,糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成,也不影響PCR反應。

        2.勻漿后加lu仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

        3.分層和 RNA沉淀時也可使用臺式離心機,2600×g離心30-60分鐘。

        預期產量:1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為:

        肝和脾 6-10μg ,腎3-4μg ,骨骼肌和腦組織1-1.5μg ,胎盤1-4μg ,上皮細胞8-15μg ,成纖維細胞5-7μg 。

        常見問題分析:

        得率低:A.樣品裂解或勻漿處理不徹底

        B.RNA沉淀未完全溶解

        A260/A280<1.65 :A.檢測吸光度時,RNA樣品沒有溶于水,而溶于了TE中。低離子濃度和低pH值條件下A280值偏高

        B.樣品勻漿時加的試劑量太少

        C.勻漿樣品時未在室溫放置5分鐘

        D.吸取水相時混入了有機相

        E.RNA沉淀未完全溶解。

        RNA降解:A.組織取出后沒有馬上處理或冷凍

        B.待提取RNA的樣品沒有保存于-60至-70℃,而保存在了-5至-20℃

        C.細胞在用胰/酶處理時過度

        D.溶液或離心管未經RNase去除處理

        E.電泳時使用的甲醛pH值低于了3.5

        DNA污染: A. 樣品勻漿時加的試劑量太少

        B.樣品中含有有機溶劑(如乙醇,DMSO等),強緩沖液或堿性溶液

        蛋白聚糖和多糖污染: 沉淀RNA的過程中作以下改進可去除這些污染,步驟7中,每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml異丙醇和0.25ml高鹽溶液(0.8M檸檬酸鈉和1.2M NaCl)混合離心,按之前操作進行。這種方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中,高效沉淀出純RNA。從含有大量多糖的植物中提取RNA時應在勻漿后離心,并加上以上操作步驟。

       

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