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    1. 上海遠慕生物科技有限公司

      蛋白磷酸化檢測需要注意的事項
      點擊次數:33 發布時間:2022-07-28

       

       

        1、樣本準備過程中防止蛋白質降解和保留翻譯后修飾

        樣本準備過程中,細胞會釋放蛋白酶和/或去磷酸化酶,為了減少這些酶的活性,處理樣本的過程應在冰上進行,并預先冷卻所有緩沖液,并且建議用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液。

        2、磷酸化特異性抗體的選擇

        選擇磷酸化特異性抗體時,選擇所要檢測位點的磷酸化抗體至關重要。磷酸化都會使蛋白質的分子量增加80Da,檢查抗體是否檢測到磷酸化靶蛋白的分子量正確的條帶也很重要。

        3、誘導磷酸化

        課題設計可能需要在收獲前刺激細胞,以確保蛋白質被磷酸化。 例如,在特定細胞信號傳導途徑激活后,靶蛋白可能在目的位點被磷酸化。

        4、濃縮樣品

        當觀察相對罕見的磷酸化事件時,可以使用最小體積的裂解緩沖液來裂解樣品達到濃縮的目的。 如果目的蛋白質的亞細胞位置已知,例如,如果您的蛋白質位于細胞核中,您可以先進行細胞分級分離,僅將細胞核裂解組份進行蛋白質印跡實驗。 您也可以考慮使用針對您感興趣的蛋白質的抗體進行免疫沉淀(IP),而不管磷酸化狀態如何。

        5、優化封閉液

        為您的抗體選擇最佳的封閉試劑。 對于磷酸化分析,可以從含酪蛋白或BSA的TBS緩沖液開始。 使用牛奶會導致更高的背景,因為它含有的蛋白質可能會干擾磷酸化蛋白質的目標檢測。 其他封閉試劑如雞卵清蛋白,魚明膠和市售合成封閉試劑也可提供可行的替代方案。 在計劃磷酸化蛋白質印跡實驗時,重要的是要記住,沒有一種適合所有樣品的封閉液。

        6、轉印膜的選擇

        可以將蛋白質轉移到硝酸纖維素或PVDF膜上。 PVDF膜具有高機械強度,需要膜剝離和再雜交時使用,通常情況下,當您使用總蛋白作為磷酸化靶標的上樣對照時。 由于PVDF具有比硝酸纖維素更高的結合能力,因此優選用于低豐度的磷酸化靶標。 然而,PVDF的結合能力增強也意味著與硝酸纖維素相比,您有可能看到更高水平的非特異性結合和背景。 如果您正在進行全蛋白內參歸一化或使用熒光二抗,建議使用低熒光背景PVDF(LF PVDF)膜。

        7、洗滌

        用于執行洗滌步驟的緩沖液的類型也可以對信號與背景產生影響。 通常,與基于磷酸鹽緩沖液(PBS)相比,使用基于tris緩沖液(TBS)通??梢援a生更強的信號。 注意,PBS中磷酸根離子的存在可能干擾來自磷酸化靶蛋白的信號。 在洗滌緩沖液中加入Tween-20等洗滌劑也有助于去除非特異性結合在膜上的物質。

        8、總蛋白質的檢測

        使用檢測目標蛋白總水平的抗體,可以確定相對于總目標蛋白的磷酸化比例。這使您可以比較不同處理的影響,并提供內參。

        9、總蛋白內參歸一化

        總蛋白內參歸一化是一種用于量化目標蛋白質豐度的技術。這涉及將條帶灰度值按照樣品中總蛋白質進行標準化。

       

       

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